Struttura cristallina di un elemento di replicazione dell'RNA a quadrifoglio enterovirale 5 ′ altamente conservato

Nature Communications volume 14, numero articolo: 1955 (2023) Citare questo articolo

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L'estremità 5′ estrema del genoma dell'RNA dell'enterovirus contiene un dominio conservato a forma di quadrifoglio che recluta le proteine ​​3CD e PCBP necessarie per avviare la replicazione del genoma. Qui, riportiamo la struttura cristallina con una risoluzione di 1,9 Å di questo dominio dal genoma CVB3 in complesso con un chaperone anticorpale. L'RNA si ripiega in una giunzione a quattro vie di tipo H antiparallela comprendente quattro sottodomini con eliche sA-sD e sB-sC impilate coassialmente. Le interazioni a lungo raggio tra un A40 conservato nel ciclo sC e l'elica Py-Py all'interno del sottodominio sD organizzano orientamenti quasi paralleli delle eliche sA-sB e sC-sD. I nostri studi NMR confermano che queste interazioni a lungo raggio si verificano in soluzione e senza chaperone. Le analisi filogenetiche indicano che la nostra struttura cristallina rappresenta un'architettura conservata di domini enterovirali simili a quadrifoglio, comprese le interazioni A40 e Py-Py. Gli studi sul legame proteico suggeriscono inoltre che l’architettura a forma di H fornisce una piattaforma già pronta per reclutare 3CD e PCBP2 per la replicazione virale.

Il genere enterovirus della famiglia Picornaviridae comprende numerosi virus patogeni responsabili di molte malattie umane, come il comune raffreddore, la poliomielite, la paralisi flaccida acuta e la miocardite1,2,3. Questi virus contengono un genoma di RNA a filamento singolo con senso (+) con circa 7500 nucleotidi (nt), che è poliadenilato all'estremità 3′ e collegato covalentemente con la proteina virale VPg all'estremità 5′ (Fig. 1a)4 ,5,6,7. L'intero genoma è costituito da un singolo open reading frame (ORF) fiancheggiato dalle regioni non tradotte (UTR) 5' e 3' altamente conservate. Il ~ 750-nt 5′-UTR ospita domini di RNA modulari essenziali per la traduzione e la replicazione del genoma virale all'interno delle cellule ospiti (Figura 1 supplementare). Circa 660 nts del 5′-UTR dalla posizione 90 a 750, situati immediatamente a monte dell'ORF, contribuiscono a un sito di ingresso ribosomiale interno (IRES) che promuove la traduzione del genoma virale attraverso un meccanismo indipendente dal cappuccio8,9,10,11. I restanti 90 nuclei all'estremità 5′ estrema di un genoma enterovirale sono essenziali per la replicazione e è stato proposto di adottare una struttura secondaria di RNA a quadrifoglio (5′CL) che funge da piattaforma per integrare i fattori proteici virali e cellulari richiesti per avviare la replicazione del genoma virale8,12,13,14,15. Qui, riportiamo una struttura cristallina ad alta risoluzione di un RNA a quadrifoglio enterovirale intatto da un membro della specie di enterovirus B: il coxsackievirus B3 (CVB3).

uno schema del genoma di un enterovirus che descrive la posizione del 5′CL e la sua struttura secondaria proposta con siti di legame putativi per il 3CD virale e le proteine ​​PCBP dell'ospite. b Struttura secondaria del costrutto di cristallizzazione CVB3 5′CL2a basato su precedenti analisi biochimiche, in cui il motivo legante l'epitopo 5′-GAAACAC-3 ′ Fab BL3-6 sostituisce l'anello L2 del sottodominio sB. I nucleotidi colorati in grigio rappresentano le mutazioni o inserzioni rispetto alla sequenza wild-type. c La struttura cristallina del CVB3 5′CL2a cocristallizzata con il Fab BL3-6 e risolta con una risoluzione di 1,9 Å. Il Fab è oscurato nelle viste ruotate della struttura dell'RNA per maggiore chiarezza. I pannelli delle figure e le etichette corrispondenti sono colorati in modo analogo per un facile confronto.

Il 5′CL è altamente conservato tra tutti i membri del genere enterovirus. A causa di una così elevata conservazione delle caratteristiche strutturali tra i 5′CL enterovirali, è stato dimostrato che i genomi enterovirali chimerici con 5′CL scambiati generano particelle virali vitali16,17,18. La struttura secondaria dell'RNA proposta è costituita da quattro sottodomini altamente organizzati designati sA, sB, sC e sD (Fig. 1a). Il sottodominio sA forma il gambo base del quadrifoglio, mentre i sottodomini sB, sC e sD si ripiegano ciascuno in una distinta struttura ad anello del gambo. Il sottodominio sD recluta la proteina di fusione virale 3CD - un precursore della proteasi virale 3C e della RNA polimerasi virale RNA-dipendente (RdRp) D - attraverso interazioni specifiche del ciclo sD con la proteasi 3C17,19,20,21. Il sottodominio sB con una sequenza ricca di C nel suo loop recluta la proteina legante il poli(C) ospite (PCBP) per facilitare la circolarizzazione del genoma virale attraverso le interazioni con la proteina legante il poli(A) (PABP) complessata con i 3 Coda poli(A) con estremità ′19,22,23,24,25,26,27,28,29. Un dominio di RNA ad ansa staminale, cre, all'interno della regione codificante 2C del genoma virale, interagisce anche con il 3CD30,31,32, promuovendo l'uridilazione della proteina virale VPg31,33, che successivamente funge da primer per il (-) Sintesi di RNA a filamento mediante RdRp D30,34. Inoltre, è stato dimostrato che la sequenza e l'integrità strutturale dei 5′CL influenzano l'uridilazione di VPg e la stabilità genomica, sottolineando molteplici ruoli critici delle caratteristiche strutturali dell'RNA all'interno degli enterovirali 5′CL14,35. Nonostante le intense pressioni selettive, l’elevata conservazione del 5′CL nei genomi enterovirali evidenzia anche i requisiti virali per preservare le strutture di RNA primarie, secondarie e terziarie del 5′CL per le interazioni con le proteine ​​ospiti e di derivazione virale durante il genoma virale replica. Tuttavia, ci mancano le strutture tridimensionali ad alta risoluzione del 5′CL enterovirale intatto, limitando la nostra comprensione di questo processo virologico fondamentale che ha un enorme potenziale per lo sviluppo di terapie mirate contro le infezioni enterovirali.