Le strutture cristalline rivelano meccanismi catalitici e regolatori del duale

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4880 (2022) Citare questo articolo

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L'enzima E1 Uba6 avvia la trasduzione del segnale attivando l'ubiquitina e la proteina simile all'ubiquitina FAT10 in un processo in due fasi che coinvolge la catalisi sequenziale dell'adenilazione e la formazione del legame tioestere. Per ottenere informazioni meccanicistiche su questi processi, abbiamo determinato la struttura cristallina di un complesso Uba6/ubiquitina umano. Si osservano due distinte architetture del complesso: una in cui Uba6 adotta una conformazione aperta con il sito attivo configurato per la catalisi dell'adenilazione, e una seconda conformazione chiusa drasticamente diversa in cui il sito attivo dell'adenilazione viene smontato e riconfigurato per la catalisi della formazione del legame tioestere . Sorprendentemente, una molecola di inositolo esakisfosfato (InsP6) si lega a un sito allosterico precedentemente non identificato su Uba6. I nostri dati strutturali, biochimici e biofisici indicano che InsP6 inibisce allostericamente l'attività di Uba6 alterando l'interconversione delle conformazioni aperta e chiusa di Uba6, migliorandone anche la stabilità. Oltre a rivelare i meccanismi molecolari della catalisi da parte di Uba6 e la regolazione allosterica delle sue attività, le nostre strutture forniscono un quadro per lo sviluppo di inibitori specifici di Uba6 e aumentano la possibilità di regolazione allosterica di altri E1 da parte di metaboliti cellulari presenti in natura.

La modifica post-traduzionale (PTM) delle proteine ​​da parte dell'ubiquitina (Ub) e delle proteine ​​simili a Ub (Ubls) è alla base della regolazione di processi cellulari fondamentali tra cui il controllo del ciclo cellulare, la riparazione del DNA, la trasduzione del segnale e l'immunità1. La coniugazione Ub/Ubl richiede le interazioni sequenziali e le attività di cascate parallele di enzimi comprendenti E1, E2 e più spesso E3, che insieme attivano, trasportano e legano Ub/Ubl alle proteine ​​bersaglio2. I due Ub E1 umani, Uba1 e Uba6, funzionano come guardiani della cascata di coniugazione Ub accoppiando l'idrolisi dell'ATP (adenilazione) con la formazione di un collegamento tioestere E1-Ub ad alta energia (tiolazione). Questo è poi seguito dal trasferimento dell'Ub attivato a repertori distinti di enzimi E2 affini (transtioesterificazione)3,4,5,6,7,8,9. Mentre Uba1 è specifico per l'attivazione di Ub, Uba6 mostra una doppia specificità per Ub e FAT10 5,8, essendo quest'ultimo un Ubl coinvolto nella progressione mitotica10, nell'immunità11,12,13,14 e implicato nel cancro15,16,17,18,19 ,20,21.

Sebbene Uba6 sia sfuggito fino ad oggi alla caratterizzazione strutturale, numerosi studi hanno dimostrato che Uba1 è un grande enzima multidominio in cui ciascun dominio svolge un ruolo funzionale distinto durante la catalisi dell'adenilazione di Ub22,23, formazione del legame tioestere E1~Ub24,25,26, e transtioesterificazione E1-E2-Ub27,28,29,30. I domini di adenilazione attivi e inattivi (rispettivamente AAD e IAD) sono responsabili del reclutamento iniziale di Ub e ospitano anche il meccanismo catalitico per l'adenilazione del C-terminale di Ub nella prima fase dell'attivazione di Ub. Il dominio E1 Cys è organizzato come due semidomini globulari chiamati primo e secondo semidominio catalitico della cisteina (FCCH e SCCH, rispettivamente). Il dominio FCCH gioca un ruolo nel riconoscimento di Ub e il dominio SCCH che ospita il residuo catalitico di cisteina coinvolto nella formazione del legame tioestere di Ub durante la seconda fase dell'attivazione di Ub. Studi recenti hanno rivelato che gli E1 subiscono grandi cambiamenti conformazionali necessari per l'adenilazione e la formazione del legame tioestere24,25,31,32. Studi su Uba125, così come E1 per Ubl SUMO, hanno dimostrato che l'adenilazione avviene con E1 in una conformazione "aperta" e che la formazione del legame tioestere comporta una rotazione di ~ 130° (o "chiusura") del dominio SCCH che transita la cisteina catalitica nel sito attivo31. Infine, il dominio ubiquitin-fold (UFD) è coinvolto nel riconoscimento molecolare di E2 e nel successivo trasferimento di Ub dalla cisteina catalitica E1 a E226,27,28,29,30. Si prevede che Uba6 ospiti un'organizzazione di dominio simile a Uba1 in base all'analisi della sequenza5. In assenza di dati strutturali, tuttavia, i meccanismi molecolari mediante i quali Uba6 attiva Ub e FAT10 sono sconosciuti. Inoltre, mentre quasi tutto l'Uba1 nelle cellule di mammifero in proliferazione è nello stato Uba1~Ub attivato, l'Uba6 è attivato solo al 50% in condizioni simili6,33. La base molecolare di questa differenza resta da determinare.